La Cathédrale de Montepulciano, dédiée à Santa Maria Assunta, se dresse dans la partie la plus élevée du village et pour y accéder, il faut gravir la colline abrupte sur laquelle la vieille ville se trouve : un effort récompensé par le fait de se retrouver sur l'une des plus belles places d'Italie.
La Cathédrale a été construite entre 1586 et 1680 suivant un projet d'Ippolito Scalza, à la place de l'ancienne église paroissiale de Santa Maria et a été consacrée le 19 juin 1712. La seule structure qui subsiste de la construction précédente est l’imposant clocher du XVe siècle, dont la partie supérieure n'a jamais été achevée. La façade saillante est également inachevée. La structure architecturale interne, d'origine florentine, est austère et élégante grâce à la clarté des surfaces en plâtre qui alternent avec les bandes de murs en pierre.
Parmi les principales œuvres conservées dans la Cathédrale de Montepulciano, on trouve le monumental Triptyque de l'Assomption, peint par Taddeo di Bartolo en 1401, placé sur le maître-autel, mais aussi le Monument funéraire de Bartolomeo Aragazzi, datant du XVe siècle, réalisé par Michelozzo entre 1427 et 1436. Aujourd'hui, le monument est divisé en neuf fragments, dont sept sont emmurés en différents endroits de l'église.
Sans oublier la petite toile sur support en bois du XVe siècle de Sano di Pietro dédiée à la Madonna del Pilastro et la terre cuite émaillée d'Andrea Della Robbia datée de 1512 sur l'autel de Gigli.